【摘要】 　　目的建立ＨＰＬＣ 梯度洗脫法測(cè)定天山花楸葉與果中綠原酸含量的方法。方法采用ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ）色譜柱，甲醇－０．０２％磷酸溶液為流動(dòng)相（梯度洗脫），流速為１．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１，檢測(cè)波長(zhǎng)為３２６ ｎｍ。結(jié)果綠原酸線(xiàn)性范圍為３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ，葉中綠原酸含量１．９８２％ （RSD＝０．５８％，n＝３），平均回收率為９９．４２％；果中綠原酸含量２．２５９％ （RSD＝１．２％，n＝３），平均回收率為９９．３２。結(jié)論 該方法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠，可用于該藥材的質(zhì)量控制。

　　【關(guān)鍵詞】  天山花楸 綠原酸 液相色譜法 梯度洗脫

　　Abstract：ObjectiveＴo establish ｍｅｔｈｏｄｓ ｆor ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Sorbus tianschanica．MethodsＴｈｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｏｆ ＯＤＳ ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５ μｍ） ｃｏｌｕｍｎ ａｎｄ ＭｅＯＨ －０．０２％Ｈ３ ＰＯ３ ａｓ ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ．Ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ １．０ ｍｌ· ｍｉｎ－１ ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉon ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３２６ ｎｍ．ResultsＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｌｉｎｅａｒ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ．Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ １．９８２％（RSD％ ＝０．５８，n＝３）ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．４２％. Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｆ S．tianschanica ｗａｓ ２．２５９％（RSD％ ＝１．２，n＝３） ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９９．３２％．ConclusionＴｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｑｕｉｃｋ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ Ｓ．ｔｉａｎｓｃｈａｎｉｃａ．

　　Key words：Sorbus tianchanica；  Ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ；  ＨＰＬＣ；  Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ

　　薔薇科Rosaceae 花楸屬植物天山花楸Sorbus tianschanica，為維吾爾和哈薩克族民間常用藥材。藥理實(shí)驗(yàn)顯示［１ ～３］ ，天山花楸枝葉兼有止咳、平喘、強(qiáng)心等多種藥理功效，并且毒性很低。綠原酸是天山花楸中有效成分之一，廣泛存在于自然界，屬于咖啡酰奎尼酸衍生物，是植物體內(nèi)有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類(lèi)化合物，為眾多藥材抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分。綠原酸除了抗氧化能力強(qiáng)外，還具有抗艾滋病毒、抗過(guò)敏、抗腫瘤等功能［４ ～７］ 。由于天山花楸中的綠原酸定量研究尚未見(jiàn)報(bào)道，為了了解天山花楸中綠原酸的含量，更全面、綜合地評(píng)價(jià)這一藥用植物，更好地控制藥材質(zhì)量，開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)中藥材的潛力，我們建立了測(cè)定天山花楸葉與果中綠原酸的液相色譜方法［８，９］ 。

　　1  儀器與試藥

　　Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ 型液相色譜系統(tǒng)，配有：四元泵，紫外檢測(cè)器，ＨＰ１１００ 化學(xué)工作站；日本島津ＵＶ ２４０１（ＰＣ）紫外光譜儀；德國(guó)Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＢＰ２１１Ｄ 十萬(wàn)分之一電子分析天平；索氏抽提裝置；甲醇為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純；天山花楸供試品自制；綠原酸對(duì)照品由中國(guó)藥品生物檢定所提供。

　　2  方法與結(jié)果

　　2.1  色譜條件色譜柱為ＺＯＲＢＡＳ ＯＤＳ Ｃ１８ （４．６ ｍｍ ×１５ ｃｍ，５μｍ）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為３２６ ｎｍ；柱溫３５℃；流速１．０ ｍｌ·ｍｉｎ－１ ；進(jìn)樣量２０ μｌ。流動(dòng)相洗脫梯度見(jiàn)表１。

　　表1  流動(dòng)相梯度洗脫（略）

　　2.2  對(duì)照品溶液和供試品溶液制備

　　2.2.1  綠原酸對(duì)照品溶液稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品約２０ ｍｇ，精密稱(chēng)定，置１００ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇溶液稀釋至刻度，作為貯備液。精密吸取貯備液５ ｍｌ，置２５ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

　　2.2.2  天山花楸葉供試品取６０ ℃常壓干燥至恒重天山花楸葉粉末約０．５ ｇ，各３ 份，置索氏提取器中，加乙醚約８０ ｍｌ，加熱回流至無(wú)色，棄去乙醚，藥渣揮干，再加甲醇８０ ｍｌ，加熱回流提取至無(wú)色，轉(zhuǎn)移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待測(cè)天山花楸葉供試品溶液。

　　2.2.3  天山花楸果供試品取３ 份６０ ℃常壓干燥至恒重的天山花楸果實(shí)粉末約０．５ ｇ，置索氏提取器中加甲醇８０ ｍｌ，加熱回流提取至無(wú)色，移至１００ ｍｌ 容量瓶中，甲醇定容，即得待測(cè)天山花楸果供試品溶液。

　　2.3  線(xiàn)性關(guān)系考察及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密移取１．０，２．０，３．０，４．０，５．０  ｍｌ 綠原酸對(duì)照品溶液，分別置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，用０．４５ μｍ 濾膜過(guò)濾，收集續(xù)濾液，進(jìn)樣量２０ μｌ，按上述色譜條件測(cè)定。以基線(xiàn)構(gòu)成之面積稱(chēng)峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積Ａ 對(duì)對(duì)照品濃度（μｇ／ｍｌ）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：A＝４６．１０７C－５９．５３２，r＝０．９９９ ６。綠原酸線(xiàn)性范圍為３．９５２ ～１９．７６ μｇ／ｍｌ。取上述對(duì)照品溶液，每隔２ ｈ 按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果表明在１２ ｈ 內(nèi)基本穩(wěn)定（RSD＝２．８％）。

　　2.4  精密度實(shí)驗(yàn)精密移取對(duì)照品液２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，照“２．３”項(xiàng)下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣５ 次，綠原酸含量RSD＝２．７％。

　　2.5  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精密量取已知綠原酸含量的葉與果供試品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”項(xiàng)下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣５ 次，葉的綠原酸含量RSD＝２．８％；果的綠原酸含量RSD＝０．７４％。

　　2.6  回收率實(shí)驗(yàn)精密移取已知綠原酸含量的樣品０．８ｍｌ，置１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，精密加入定量低、中、高濃度的對(duì)照品液，加甲醇稀釋至刻度，照“２．３”項(xiàng)下操作測(cè)定。葉：平均回收率＝９９．４２％，RSD＝２．１％（n＝９）；果：平均回收率＝９９．３２％，RSD＝２．４％（n＝９）。

　　2.7  樣品測(cè)定精密量取供試品溶液０．８ ｍｌ，移至１０ ｍｌ 棕色容量瓶中，甲醇定容，照“２．３”項(xiàng)下進(jìn)樣，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，即得。結(jié)果：天山花楸葉中綠原酸的平均含量為１．９８２％， RSD ＝０．５８％（n＝３）；天山花楸果中綠原酸的平均含量為２．２５９％，RSD＝１．２％（n＝３）。見(jiàn)圖１。

　　圖１  綠原酸ＨＰＬＣ 色譜圖（略）

　　3  討論

　　對(duì)照品綠原酸對(duì)其進(jìn)行紫外掃描，綠原酸在３２６ ｎｍ 有較強(qiáng)吸收，因此選擇３２６ ｎｍ 為測(cè)定波長(zhǎng)。

　　曾選擇甲醇－０．０２％磷酸溶液（１０∶９０）的等度洗脫色譜條件，但綠原酸保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，ｔＲ 為１４ ｍｉｎ， 一次檢測(cè)完成約需３０ｍｉｎ。經(jīng)摸索后采用梯度洗脫，使待測(cè)組分綠原酸以較短時(shí)間ｔＲ為４．４ ｍｉｎ 出峰，隨后使洗脫梯度變大，流動(dòng)相的極性也變大，極性弱的組分快流出柱。

　　【參考文獻(xiàn)】

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